http://dx.doi.org/10.32911/as.2018.v11.n2.579
Aporte Santiaguino 11(2), julio-diciembre 2018: 251-262
ISSN-L 2616-9541
Variabilidad intragenotípica de Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” provenientes de la cuenca baja del río Supe-Barranca
Intragenotypic variability of Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” from the lower river basin of the Supe- Barranca
Juana Aliaga Camarena1,
Edwin Vega Portalatino1,
1 Universidad Nacional de Barranca. Barranca, Perú.
Resumen:
Capsicum chinense “ají Supano” es un ecotipo propio de la campiña de Supe muy apreciado en la culinaria regional por su aroma y sabor. Este ecotipo a la fecha carece de estudios, por lo que el objetivo del presente estudio es determinar el patrón molecular para identificar la variabilidad intragenotípica de 30 individuos, usando marcadores moleculares ISSR. Se colectaron frutos provenientes de cuatro agricultores durante el mes de noviembre del 2016, seleccionándose al azar las semillas, para su establecimiento en macetas en casa malla. Se extrajo el ADN de tres hojas jóvenes usando el método Micro – CTAB modificado en el laboratorio de Biotecnología del PIPS en Cereales y Granos Nativos de la UNALM para su análisis molecular. Para la corrida se seleccionó los Primers SSR 22, UCB 807, UCB 810 y UCB 841 por su alta resolución y obtención de bandas; los cuales no detectaron bandas diferentes entre los individuos evaluados confirmando que es un ecotipo autógamo donde todos los individuos de la población son genéticamente iguales, por lo tanto, no existe variabilidad intragenotípica.
Palabras clave: ISSR; Capsicum chinense Jacq.; ají Supano; Barranca.
Abstrac:
Capsicum chinense “ají supano” is an ecotype typical of the countryside of Supe very appreciated in the regional cuisine for its aroma and flavor. This ecotype to date has no studies, so the objective of the present study is to characterize it molecularly to identify intragenotypic variability of 30 individuals of chili peppers from the lower Supe river basin using molecular markers ISSR. Fruits were collected from four farmers during the month of November, 2016, being the seeds selected randomly, for their establishment in pots in house mesh. DNA was extracted from three young leaves using the Micro - CTAB method modified by Biotechnology Lab of PIPS in Cereals and Native Crops of UNALM to molecular analysis. Primers SSR 22, UCB 807, UCB 810 and UCB 841 were selected due their high resolution and banding; which did not detect different bands among the individuals evaluated, confirming that it is an autogamous ecotype, all the individuals of the population are genetically equal, therefore there is no intragenotypic variability.
Keywords: ISSR; Capsicum chinense Jacq.; chili Supano; Barranca.
INTRODUCCIÓN
El ají (Capsicum spp.) es uno de los cultivos más importantes del mundo y está formado por alrededor de 30 especies, dentro de las cuales destacan C. annuum L., C. frutescens L., C. pubescens Ruíz & Pavón, C. chinense Jacq. y C. baccatum L., como las especies cultivadas de mayor importancia (Bosland y Votava, 2012).
De acuerdo a su origen el ají proviene de las tierras bajas de la cuenca Amazónica y de ahí se dispersó a Perú durante la época prehispánica (Salaya, 2010).
Debido a la falta de conocimientos sobre diversidad genética que conservan los productores en sus parcelas de cultivo o huertos familiares, conlleva al conocimiento limitado de la distribución geográfica del género Capsicum y de la variabilidad de las especies que se cultivan de forma comercial y para autoconsumo. En ese sentido, los recursos fitogenéticos relacionados con el género Capsicum, adquieren gran relevancia por el potencial genético que presentan y por ser la base para obtener variedades mejoradas. (Moreno et al., 2011: 23 - 30)
Tradicionalmente, las especies de Capsicum han sido identificadas y caracterizadas descriptores morfológicos basado en el número de ramas por planta, la altura de la planta, número de frutos por planta, morfología de la flor y morfología del fruto (Fekadu et al., 2008). Sin embargo, los marcadores moleculares diferencian a los Capsicum con más detalles sin la interferencia causada por los efectos ambientales (Arif et al., 2010; Leal et al., 2010; Oliveira et al., 2010).
La gran mayoría de estudios reportados, mencionan que el 80% de los materiales están caracterizados con descriptores morfológicos y un 40% con caracterización bioquímica; sin embargo, no existe la caracterización molecular, a pesar que estudios recientes apoyan la decisión de incluir la caracterización molecular en el estudio de colecciones de germoplasma y en particular del género Capsicum (Sanwen et al., 2001; Kumar et al., 2001).
En general, la técnica de ISSR ha sido ampliamente utilizada debido a su simplicidad, rentabilidad y potencia para detectar diferencias incluso entre individuos estrechamente relacionados (Kumar et al., 2001 y Galvan et al., 2003). Esta técnica nos permite detectar la variabilidad genética a nivel del ADN genómico de cada planta (Andreev et al., 2005; Gernand et al., 2007; Jin et al., 2008).
Los marcadores moleculares ISSR han sido utilizados para varios propósitos, tales como inferencias filogenéticas (Dogan et al., 2007), evaluación de la diversidad genética (Aguilera et al., 2011), y estudios complejos de especies (Michelan et al., 2012), entre otros.
El objetivo de este trabajo es determinar si existe variabilidad intragenotípica en una muestra al azar de 30 individuos de “ají supano” a través del análisis molecular ISSR.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los frutos de la accesión Capsicum chinense Jacq. “ají supano” fueron colectados en la cuenca baja de río Supe – Barranca durante el mes de noviembre del 2016. Se registraron Tabla 1 y Figura 1 los datos de ubicación de las parcelas de los agricultores utilizando un GPS.
Tabla 1. Datos y coordenadas geográficas de las parcelas de colecta de frutos de Capsicum chinense Jacq. “Ají supano” en la cuenca baja del río Supe
Figura 1. Ubicación geográfica de las parcelas de colecta de frutos de Capsicum chinense Jacq. “Ají supano” en la cuenca baja del río Supe
De los frutos colectados y posterior mezcla de semillas se seleccionaron 30 semillas al azar y se sembraron en macetas de plástico usando sustrato estéril (50% compost y 50% arena) bajo condiciones de casa malla a temperatura de 28 ± 2 °C. A los 30 días después de la siembra se tomaron 3 hojas jóvenes de cada individuo para su posterior secado en silicagel dentro de bolsas ziploc. Luego de cuatro días. Las hojas secas fueron molidas en un molino para muestras secas Mill 200 y se procedió a la extracción de ADN.
Se realizó utilizando el método Micro – CTAB (Doyle J. y Doyle, 1987) modificado en el laboratorio de Biotecnologia del PIPS en Cereales y Granos Nativos de la Universidad Nacional Agraria. La cantidad y calidad del ADN se verificó utilizando un Biofotómetro IMPLENT a una absorbancia de A260/A280 a razón de 1,7 a 1,9 y en geles de agarosa al 1%.
La amplificación de los fragmentos se realizó utilizando marcadores moleculares ISSR (Inter Single Sequence Repeats). Se utilizaron 21 marcadores ISSR para el screening preliminar. Debido a que no se pudo determinar el nivel de polimorfismo en las muestras probadas se optó por seleccionar aquellos marcadores de mayor número de fragmentos visualizados, para la corrida electroforética en geles de acrilamida con los marcadores ISSR seleccionados tabla 2.
Tabla 2. Empleo de iniciadores o Primers seleccionados para la evaluación de los 30 individuos de Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” en la cuenca baja del Rio supe
Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se usó 3 ul de ADN genómico en una reacción conteniendo 0,4 ul dNTPs, 1,2 ul MgCl2, 0.4 ul primer, 2,5 ul taq polimerasa, 0,5 ul de albumina de bovino, 1 ul de buffer (10mM tris-HCl pH 8,3; 50mM KCl), 1 ul de agua esterilizada, en un volumen final de 10 ul.
Las reacciones de amplificación ISSR se uso un programa de 40 ciclos de incubación por cuatro horas de la siguiente manera: cada amplificación se añadió 6 ul de tampón de carga (95% de formamida, 20 mM de EDTA, 0,05 de azul de bromofenol y 0,05 de xilen cianol). La muestra fue desnaturalizada a 94ºC por 3 minutos y cargada en un gel vertical de poliacrilamida al 6% y 7 M de úrea, catalizada con Temed y APS (persulfato de amonio) en 1X triborato EDTA (TBE). La precorrida se realizó a 500 V por 30 minutos y la corrida con la muestra a 500 V por 6 horas. Los geles fueron revelados empleando tinción con nitrato de plata.
RESULTADOS
De acuerdo a la metodología utilizada en la evaluación a los 30 individuos de Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” provenientes de la cuenca baja de río Supe – Barranca se seleccionó los Primers SSR 22, UCB 807, UCB 810 y UCB 841 figura 2 por su alta resolución y obtención de bandas en gel de poliacrilamida (Nascimiento et al., 2010; Shafie et al., 2011).
El número de bandas para cada primer varió de 11 (UCB 810) a 14 (USB 841) con un promedio de 12,5 bandas por cebador tabla 3. Se generó un total de 1500 bandas (número de plántulas analizadas x número de clases de bandas con todos los primers ISSR), generando patrones monomórficos en todas las plántulas analizadas corroborando la homogeneidad genética de este ecotipo.
Tabla 3. Patrón de bandas del marcador ISSR evaluados en 30 individuos de Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” en la cuenca baja del río Supe
Figura 2. Corridas electroforéticas que muestran el grado monomórfico evaluado en 30 individuos del ecotipo Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” provenientes de la cuenca baja de río Supe – Barranca, utilizando los marcadores ISSR.
Primer SSR 22
UCB 807
UCB 810
UCB 841
DISCUSIÓN
La mayor utilidad de los ISSR ya fue establecida por los fitomejoradores (Deshpande et al., 2001) alrededor del mundo siendo utilizados como parámetros de apoyo para la evaluación en caracteres morfológicos para poder determinar la extensión de la diversidad y la relación dentro y entre las especies (Srivastava et al., 2004).
Christensen et al. (2007) plantea que un buen marcador molecular permite el estudio de la diversidad genética de las diferentes cultivares existentes, pero están limitadas por los recursos, es muy importante poder seleccionar cuales primers pueden ser más eficientes que otros en la determinación de la variabilidad genética de una población (Koskinen, 2004).
Uno de estos parámetros es el porcentaje de polimorfismo y distancia genética que son muy altas en variedades interespecíficas en comparación a variedades intraespecíficas de Capsicum. En estudios recientes el 47% de polimorfismo encontrado se ha dado dentro de las accesiones de C. annum y 89% entre las diferentes especies de Capsicum (Paran et al., 1998). Así que la tasa de polimorfismo varía dentro y entre las especies dependiendo del patrón de polinización.
También se ha reportado una estrecha relación entre C. chinense y C. frutescens documentada y descrita por estudios genéticos de similitud (Heiser y Pickersgill, 1969; Ince et al., 2010). Eshbaugh (1970) plantea que C. frutescens en su forma primitiva, podría haber sido el antepasado de C. chinense.
Muchos autores argumentan que la formación de ecotipos en especies de plantas, ocurre por la adaptación de las poblaciones a condiciones ambientales distintas a las originales (Palevitch, 1991). Así, el establecimiento de un grupo de plantas a distintas alturas, condiciones climáticas o de suelo, depende de la capacidad que tenga éste grupo para adaptarse a este ambiente (Vargas et al., 2001). Posiblemente, si el estudio se hubiera realizado para evaluar una característica morfológica, la influencia de uno o varios de los factores climáticos evaluados hubiese mostrado una correlación positiva alta, debido a un mayor efecto ambiental o de adaptabilidad (Nevo et al., 1986).
Los resultados obtenidos indican que todas las plantas de “ají Supano” colectadas de la campiña de Supe pertenecen al mismo ecotipo, debido a que las bandas formadas por cada individuo evaluado con los 4 primeros no mostraron bandas polimórficas, probablemente debido a que es una población autógama. Esto haría suponer que este ají mantiene sus características morfológicas dentro del área de estudio. Esta diversidad comparada con plantas autógamas cuyo valor de polimorfismo oscila entre 34% (e.g. Amaranthus tricolor: Xu y Sun, 2001), 28% (e.g. arroz: Girma et al., 2010) es menor con respecto a especies alógamas cuyo valor oscila entre 85,2% (eg. rabanito: Liu et al., 2008), 70,77% (e.g. coliflor: Astarini et al., 2006), etc., siendo menor al 50% de polimorfismo.
Según Font et al. (2014) reportaron que el durazno es la especie menos polimórfica del género Prunus por su condición de autogamia, revalidando los resultados obtenidos en este trabajo.
En general, la separación geográfica se considera un parámetro importante para recoger el germoplasma para el estudio de la diversidad, pero la separación geográfica no siempre predice las diferencias genéticas muy claramente (Del Rio et al., 2001).
Este estudio exploratorio, provee la justificación del seguimiento de estudios posteriores para enfocar la utilidad de este recurso genético en los programas de mejoramiento del cultivo de ají.
CONCLUSIÓN
Entre las 30 muestras analizadas de Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” no se detectaron patrones electroforéticos de ADN diferentes entre ellos, lo que confirma que todos los individuos son genéticamente iguales, por lo tanto no existe variabilidad intragenotípica.
AGRADECIMIENTO
Agradecimiento especial a la Universidad Nacional de Barranca, que financió el estudio a través del proyecto “Caracterización y sostenibilidad del cultivo de Capsicum chinense Jacq. “ají Supano” en la Cuenca baja del río Supe, Barranca” fuente de financiamiento de Donaciones y Transferencias, Resolución N° 206-2015-CO-UNAB.
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Recepción:13/09/2018
Aceptación:30/11/2018
Correspondencia
Juana Aliaga Camarena
jaliaga@unab.edu.pe